Кафедра госпитальной хирургии ЮУГМУ

Морфометрическая оценка изменений седалищного нерва крысы в контроле и при введении местных анестетиков в эксперименте

    Недзвецкий С.В., Куренков Е.Л., Тарасов А.Н.

    Челябинская государственная медицинская академия, кафедра нормальной анатомии (зав. кафедрой профессор Куренков Е.Л.), кафедра госпитальной хирургии, реаниматологии и интенсивной терапии (зав. кафедрой профессор Андриевских И.А)

    Актуальность. Вопросы нейротоксичности местных анестетиков в настоящее время остаются открытыми и недостаточно изучены. По данным разных авторов транзиторные неврологическии нарушения, развивающиеся после регионарной анестезии, составляют от 0,4 до 35% в зависимости от вида местного анестетика. В большинстве случаев данные нарушения носят преходящий характер. Тем не менее, имеются данные о развитие серьезных неврологических нарушений в виде синдрома «конского хвоста», после спинномозговой и эпидуральной анестезии [6].

    Цель работы. Изучение морфологических изменений седалищного нерва крысы в эксперименте и морфометрическая оценка повреждения нервной ткани.

    Материалы и методы. Экспериментальные исследования проведены в центральной научно-исследовательской лабораторииЧелГМА с соблюдением правил использования и содержания лабораторных животных (приказ № 755 МЗ СССР от 12.07.1977 г.), норм асептики и антисептики. Проведено 2 серии экспериментов на 42 беспородных, половозрелых крысах-самцах массой 150-200 г. Первой группе животных субневрально вводили местный анестетик Наропин 0,3 мл 0,22 мг. (n=10), второй 0.3 мл маркаин 0,15 мг (n=10), в третьей – предложенную нами оригинальную смесь 0,3мл лидокаин и маркаин 0,03мг и 0.05 мг соответственно алкалинизированная 3% раствором гидрокарбонатом натрия в объеме 0,1 мл.(n=10). Контролем служили две группы животных, которым вводили изотонический раствор натрия хлорида (n=6) и 96% спирт (n=6) в идентичном объеме. Животных выводили из эксперимента в два этапа - на 1-е и 7-е сутки после введения анестетиков и в контроле (по 21 особи на каждом сроке). Для умерщвления крыс использовали передозировку эфирного наркоза.

    Иссеченные участки седалищного нерва длиной 15-20 мм фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 24 часов. Далее кусочки нерва обезвоживали, обезжиривали и подвергали заливке в парафин. Серийные, плоскопараллельные тканевые срезы в количестве 3-6 , толщиной 5-7 мкМ помещали на предметных стеклах. Затем гистологическии срезы окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике [9, 11].

    Для идентификации миелиновых оболочек по Шпильмейеру отрезки нерва подвергались фиксации в 10% формалине в течение 5 суток, после чего из них готовили замороженные срезы, которые окрашивались гематоксилином Гейденгайна. Миелин в составе нервного волокна окрашивался в черный цвет. Объемное содержание миелиновых волокон, зон демиелинизации определяли методом точечного счета с использованием окулярных сеток [2].

    Подсчитывали не менее 1000 точек при увеличении ×400 на 5-10 случайно отобранных полях зрения для каждого наблюдения. Количество нейролеммоцитов подсчитывали в единице площади равной 0,003 мм2 при увеличении ×1000.Толщину миелиновых волокон определяли при помощи лицензионной программы анализа изображения микрообъектов «MoticImages Plus 2».

    Статистическую обработку полученных данных проводили на персональном компьютере с помощью лицензионного пакета прикладных программ «Statistica 6.0» («StatSoft, Inc.»). Применялись методы вариационной статистики: определение средней арифметической, среднее квадратическое отклонение, стандартной ошибки средней арифметической. Статистическая значимость различий сравниваемых количественных признаков проводилась с помощью непараметрического U-теста Манна-Уитни. Качественные признаки оценивали с применением точного критерия Фишера [12]. Различия считались статистически значимыми при уровне р<0,05, что соответствует 95% вероятности безошибочного прогноза.

    Результаты и обсуждение. Во всех группах крыс, которым вводились анестетики, структура нервного ствола оставалась сохраненной. Содержание миелиновых волокон в 1-е и 7-е сутки было меньшим при анестезии наропином по сравнению с контрольной группой (p<0,05) (рис. 9).

    Объемное содержание миелиновых волокон в седалищном нерве крысы в контроле и при введении анестетиков

    Вместе с тем, объемная плотность демиелинизированных зон мякотного волокна на любом сроке увеличивалась только у животных, которым инъецировали спирт (рис. 4.10).

    Объемное содержание зон демилинизации миелиновых волокон в седалищном нерве в контроле и при введении анестетиков

    Толщина миелиновых волокон в 1-е и 7-е сутки статистически значимо меньше после анестезии, чем при введении спирта. Статистически значимые различия обнаружены между контрольной группой и животными, подвергшихся анестезии наропином (9,0±0,2 мкм и 9,9±0,1 мкм в 1-е сутки и 8,9±0,1 мкм и 9,8±0,1 мкм соответственно; р<0,05) (рис. 11).

    Толщина миелиновых волокон в седалищном нерве крысы в контроле и при введении анестетиков

    Наименьшее количество нейролеммоцитов в единице площади эндоневрального пространства обнаружено в 1-е сутки после введения спирта (p<0,05). На 7-е сутки достоверных различий в содержании шванновских между группами контроля и животными, которым вводился анестетик не получено (рис. 12). 

    Содержание нейролеммоцитов в седалищном нерве крысы в контроле и при введении анестетиков

    Таким образом, результаты нашего исследования согласуются основными патогенетическими механизмами воздействия инъекционных препаратов на периферические нервы. Среди них называют сдавление нервных волокон введенным раствором, ишемию нерва в результате химического повреждения сосудов, питающих нерв и нейротоксичность [5]. При этом считается, что повреждение нервно-тканевого барьера зависит от проникающей способности и экспозиции влияющего фактора [13].

    Данные комплексного морфологического изучения показали, что альтеративные процессы в седалищном нерве присутствовали при субневральном введении использованных нами видов растворов. Их проявлением в 1-е сутки после воздействия стали отек стромы нерва, набухание миелиновых оболочек с увеличением диаметра, следовательно, объемной доли мякотных волокон, что согласуется с литературными данными [10, 14]. К 7-м суткам нарастание повреждения миелоархитектоники нерва и развитие экссудативной фазы воспаления имелось только в группе крыс, которым вводили спирт. Картина наблюдаемой нами уоллеровской дегенерации миелиновых волокон периферического нерва согласно литературным данным сохраняется до 14-16 дней после воздействия [1, 16]. В контрольной группе и у животных при введении анестетиков, смеси восстановление структуры нервного ствола происходило к концу первой недели. Отек, появление скудной лейкоцитарной инфильтрации эндоневрия на 7-е сутки после анестезии наропином, вероятно, обусловлены его физико-химическими свойствами, а именно, плохой растворимостью в воде [15]. Возможно, это приводит к более низкой утилизации (всасываемости) препарата в зоне инъекции по сравнению с маркаином и физиологическим раствором. Во всех группах к 7-м суткам наряду с увеличением зон демиелинизации нарастало количество шванновских клеток. Это свидетельствует о репаративных процессах в нервных волокнах, обусловленных пролиферацией клеток-сателлитов нейронов [4, 8, 17].

    Полученные нами морфометрические результаты демонстрируют отсутствие значительных различий при использовании в качестве анестетика предложенной смеси по сравнению с контрольной группой. Помимо кратковременности и слабой выраженности повреждения нервной ткани при ее применении морфофункциональное восстановление нерва происходило в короткие сроки, что, вероятно обусловлено влиянием компонентов смеси.

    Литература.

    1. Абдуллаев М.-С., Изменения миелоархитектоники нервов человека в условиях хронической ишемии / М.-С. Абдуллаев // Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. – 1988. – Т. XCIV. - № 4. – С. 86-95.

    2. Автандилов Г.Г., Медицинская морфометрия / Г.Г. Автандилов. - М.: Медицина, 1990. – 383 с.

    3. Акоев Г.Н., Регенерация седалищного нерва кролика после перерезки и применения различных хирургических методов / Г.Н. Акоев, Г.С. Кокин, Е.И. Чумасов и др. // Вопросы нейрохирургии. – 1988. - № 6. – С. 32-37.

    4. Архипова С.С., Клетки-сателлиты спинального ганглия крысы после имплантации эмбриональной нервной ткани в разрыв седалищного нерва / С.С. Архипова, И.С. Рагинов, Г.А. Фомина и др. // Морфологические ведомости. – 2007. - № 3-4. – С. 8-12.

    5. Берснев В.П., Постинъекционные повреждения периферических нервов / В.П. Берснев, А.В. Бабин, Е.И. Чумасов, К.М. Светикова // Вопросы нейрохирургии. – 1991. - № 1. – С. 25-27.

    6. Волчков.В.А. Болевые синдромы в анестезиологии и реаниматологии/ Волчков.В.А., Игнатов.Ю.Д., Страшнов.В.И.// М.; МЕДпресс-информ,2006.-320 с.

    7. Евтушенко В.П., Клинико-морфологическая характеристика хронического эндоцервицита: дис. … канд. мед. наук / В.П. Евтушенко. - Челябинск. – 2003. – С. 46. 

    8. Жук О.Н., Влияние фактора роста нервов на регенерацию волокон в седалищном нерве крыс / О.Н. Жук, В.Н. Калюнов // Морфология. – Т. 110. - № 4. – С. 113-115. 

    9. Лилли Р.Д., Патогистологическая техника и практическая гистохимия / Р.Д. Лилли. – М., 1969. – 645 с.

    10. Мирошникова М.Е., Регенерация седалищного нерва крысы после его различных экспериментальных повреждений / М.Е. Мирошникова, Е.И. Чумасов // Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. – 1988. – Т. XCV. - № 1. – С. 30-35. 

    11. Пирс Э., Гистохимия теоретическая и прикладная: Пер. с англ. / Э. Пирс. – М., 1962. – 962 с. 

    12. Реброва О.Ю., Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTIKA / О.Ю. Реброва.- М.: Медиасфера, 2003. - 312 с.

    13. Солнышкова Т.Г., Ультраструктурные изменения коры полушарий большого мозга при острой и подострой интоксикации природным сероводородсодержащим газом / Т.Г. Солнышкова, В.А. Шахламов // Арх. патологии. – 2003. – Т. 65. - № 2. – С. 17-20.

    14. Солнышкова Т.Г., Патоморфологические изменения микроглии при хронической интоксикации сероводородсодержащим газом / Т.Г. Солнышкова, Ю.Г. Пархоменко // Арх. патологии. – 2003. – Т. 65. - № 3. – С. 41-44.

    15. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России: Справочник. – М.: АстраФармСервис, 2004. – 1390 с. 

    16. Чумасов Е.И., Регенерация нервов под влиянием бализа-2 и лактовита / Е.И. Чумасов., А.Я. Шурыгин, С.Ю. Солдатова и др. // Морфология. – 1993. – Т. 104. - № 5-6. – С. 25-33.

    17. Ramer M., Functional regeneration of sensory axon into adult cord / M. Ramer, J. Priestley, S. McMahon // Nature. – 2000. – V. 403. – P. 312-316.